目的  研究GSTP1和SLCO1B1基因多态性与儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）患儿使用大剂量甲氨蝶呤（HD-MTX）化疗后出现排泄延迟及不良反应的相关性及预测价值。

方法  选择2021年1月至2022年12月南京医科大学附属儿童医院80例ALL患儿为研究对象，采用聚合酶链式反应（PCR）法测定所有患儿GSTP1（rs1695、rs537387344）和SLCO1B1（rs2306283、rs4149056）等位点的基因多态性，采用均相酶扩大免疫分析（EMIT）法测定MTX血药浓度，记录在接受HD-MTX治疗过程中发生的不良反应。用单因素分析GSTP1和SLCO1B1基因多态性、HD-MTX排泄延迟及不良反应的相关性，并得出显著性因素；用多因素Logistic回归筛选出预测因子，绘制受试者工作特征（ROC）曲线评价预测价值。

结果  SLCO1B1 rs4149056 TC与排泄延迟具有相关性；72 h血药浓度、GSTP1 rs1695 AA、SLCO1B1 rs4149056 TC基因型与MTX化疗后不良反应的发生具有相关性，差异有统计学意义（P＜0.05）。ROC曲线分析结果表明，SLCO1B1 rs4149056 TC预测HD-MTX排泄延迟的曲线下面积（AUC）为0.618，GSTP1 rs1695 AA与SLCO1B1 rs4149056 TC预测HD-MTX不良反应的AUC分别为0.623和0.704。

结论  SLCO1B1 rs4149056 TC基因型可能增加HD-MTX化疗后发生排泄延迟的风险，GSTP1 rs1695 AA、SLCO1B1 rs4149056 TC基因型可能是发生不良反应的危险因素。SLCO1B1基因多态性对HD-MTX化疗后排泄延迟和不良反应具有一定的预测价值。

大剂量甲氨蝶呤（high-dose methotrexate，HD-MTX）是儿童急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）化疗方案的核心，但MTX个体间药代动力学差异大，化疗过程中易发生排泄延迟、肝肾功能损害、骨髓抑制和胃肠道等不良反应，导致不得不减少用量甚至中断化疗。据文献报道，药物代谢酶和转运体的遗传变异可能是引起药物体内代谢和药物反应出现差异的因素之一[1-2]。

谷胱甘肽转移酶P1（glutathione s-transferasespi，GSTP1）是参与儿童ALL化疗方案中MTX代谢的一类重要的解毒代谢酶，主要通过催化MTX与谷胱甘肽（glutathione，GSH）等亲水性结合，降低GSH复合物毒性而发挥解毒作用；有机阴离子转运多肽1B1（organic anion trans-porting polypeptide 1B1，OATP1B1）是主要的摄取转运体之一，特异表达在肝细胞膜上，除介导胆汁酸等内源性物质摄取外，还介导外源性物质和药物的转运。研究结果显示，OATP1B1起到体内甲氨蝶呤消除的限速作用，而参与其编码的SLCO1B1的基因多态性与MTX体内药代动力学差异有关[3-4]。

同时，MTX血药浓度与临床疗效及不良反应关系密切，血药浓度个体间差异大、原因复杂。临床上通常认为48 h MTX血药浓度≥1 moL/L可称为排泄延迟，排泄延迟可增加不良反应发生的风险[3-5]。有研究认为，MTX个体排泄差异可能与参与药物代谢、转运的基因序列改变有关 [6]。GSTP1与OATP1B1作为MTX重要的代谢酶与主要摄取转运体，两者与MTX排泄延迟及不良反应可能存在相关性。

目前，已有MTX代谢酶SLCO1B1和GSTP1对MTX化疗不良反应的相关性研究，但结论未能达成一致，且尚无联合考察SLCO1B1和GSTP1两种代谢酶的研究。本试验对GSTP1和SLCO1B1基因多态性进行联合检测，同时研究基因多态性与HD-MTX排泄延迟和不良反应的相关性，旨在探讨上述基因的多态性对HD-MTX排泄延迟及不良反应的影响和预测价值，为临床ALL患儿的个体化用药方案提供参考。

1 资料与方法

1.1 病例资料

选取2021年12月至2022年12月南京医科大学附属儿童医院（以下简称“我院”）ALL患儿80例。纳入标准：①患者经过形态学、免疫学、遗传学及分析生物学检查，确诊为ALL；②所有患儿均经过早期化疗处于完全缓解状态；③化疗前患儿经血常规、尿常规、肝肾功能、心电图、心肌酶检查均正常，无化疗禁忌及感染症状。排除标准：临床数据资料记录不全，未常规进行MTX血药浓度监测或24，48，72 h 3个时间点甲氨蝶呤血药浓度数据不全者。本研究取得患儿家长的知情同意，并通过我院医学研究伦理委员会审查（批件号：202307029-1）。

1.2 用药方案

MTX剂量为3~5 g/m²，总剂量的1/10作为突击量于前30 min内快速静脉滴入，余量于后23.5 h内匀速滴入，化疗期间监测肝肾功能，并常规对口腔黏膜、胃肠道以及重要脏器进行保护。MTX用药36 h后使用四氢叶酸钙解救，每次15 mg/m²，每6 h静脉注射1次，依据48 h甲氨蝶呤血药浓度进行调整，＜1 μmoL/L时，四氢叶酸解救剂量为15 mg/m²；1~2 μmoL/L时，四氢叶酸 30 mg/m²；＞2 μmoL/L时，四氢叶酸 45 mg/m²；解救至甲氨蝶呤血药浓度＜0.1 μmoL/L。48 h甲氨蝶呤血药浓度＞1  μmoL/L时每12 h测定1次血药浓度。

1.3 MTX血药浓度测定及分组

于HD-MTX化疗开始后的24，48，72 h采集静脉血2 mL，送至我院药学研究中心治疗药物监测实验室，采用均相酶扩大免疫分析（enzyme-multiplied immunoassay test，EMIT）法，使用甲氨蝶呤检测试剂盒（美国Siemens公司，批号：6L119UL-E1）在Syva Viva-E血药浓度分析仪（美国Siemens公司）上快速测定患儿血药浓度。48 h MTX血药浓度≥1 μmoL/L为排泄延迟组[5]，否则为排泄正常组。

1.4 不良反应评价

每个化疗周期内对患儿不良反应进行统一评价，标准参照美国卫生及公共服务部国立卫生研究所国家癌症研究所的不良事件常用术语评定标准5.0版（NCI-CTCAE V5.0）[7]对药物治疗所致不良反应分级评定，如不良反应评级为超过Ⅱ级，则认为该药物治疗发生了不良反应。

1.5 基因型分析

引物合成针对GSTP1基因（rs1695、rs537387344）和SLCO1B1基因（rs2306283、rs4149056）等SNPs位点用Primer Premier 5软件进行引物设计，所有引物均由华大基因科技股份有限公司合成，具体见表1。

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  表格1 PCR扩增使用的引物

  Table 1.Primer sequences of PCR amplification

  注：PCR：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）。

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PCR扩增GSTP1和SLCO1B1均为总反应体系25 μL，PCR Mix 22 μL，正反向引物各1 μL， DNA模板1 μL，反应条件均为96 ℃预变性5 min，96 ℃ 20 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35个循环，72 ℃延伸10 min。取各待测PCR产物3 μL，按序点样入1%琼脂糖凝胶孔中，以100 mV电压电泳45  min，观察条带性状。按照磁珠纯化方法对PCR产物进行纯化，纯化后进行测序。所有测序均由华大基因科技股份有限公司完成。

1.6 统计学分析

采用SPSS 21.0软件进行数据处理，参考国内外文献，选取可能对MTX排泄延迟和MTX发生毒性发应有显著相关性的因素。计数资料采用χ²分析MTX化疗后个体发生排泄延迟及发生不良反应与影响因素之间的相关性，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。采用拟合优度χ²检验判断基因型分布是否符合Hardy-Weinberg定律。

绘制预测模型的ROC曲线将上述分析得出的显著性变量结合文献报道的极显著因素纳入多因素Logistic分析，采用逐步回归法，利用筛选标准（α  _入=0.05，α _出=0.1）对自变量进行引入和剔除，绘制预测模型的ROC曲线图，计算曲线下面积（area under curve，AUC）评估其预测效力。

2 结果

2.1 基本情况

纳入分析的80例ALL患儿，其中男 35例，女45例，年龄1~11岁，平均年龄（4.9±2.1）岁。参照《儿童急性淋巴细胞白血病诊疗建议（第四次修订）》[8]的危险度分层，入组患儿分为低危组46例，中危组30例，高危组4例。共有27例（33.7%）患儿静滴MTX后出现排泄延迟；41例（51.2%）患儿不良反应评级超过Ⅱ级，主要表现为肝肾功能损害25 例（31.2%），骨髓抑制的为23例（28.7%），中性粒细胞减少17例（21.2%），胃肠道反应16例（7.5%），粘膜炎13例（16.0%）。

2.2 MTX排泄延迟的单因素分析

在80例ALL患儿中，GSTP1、SLCO1B1各SNP位点基因型分布均符合Hardy-Weinnberg遗传平衡（P＞0.05）。单因素分析显示 SLCO1B1 rs4149056 TT/TC与排泄延迟具有相关性， rs4149056 TT排泄延迟发生率为25.9%，rs4149056 TC排泄延迟发生率为50%，显著增加排泄延迟发生风险（P＜0.05），其余影响因素组间差异均无统计学意义。具体见表2。

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  表格2 HD-MTX排泄延迟单因素分析结果

  Table 2.Univariate analysis results of excretion delay of HD-MTX

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2.3 MTX发生不良反应的单因素分析

72 h血药浓度、GSTP1 rs1695 AA/AG、SLCO1B1 rs4149056 TT/TC与MTX化疗后不良反应的发生具有相关性（表3），差异有统计学意义（P＜0.05），GSTP1 rs1695 AA型患儿不良反应发生率为 60.4%，SLCO1B1 rs4149056 TC型患儿不良反应发生率为79.3%，显著增加不良反应发生的风险。其余影响因素组间差异均无统计学意义（P＞0.05）。

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  表格3 MTX不良反应单因素分析结果

  Table 3.Univariate analysis results of adverse reaction of HD-MTX

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2.4 多因素Logistic回归分析与ROC曲线

2.4.1 MTX排泄延迟多因素回归模型与ROC曲线

以是否发生排泄延迟作为因变量，以“2.2”项分析得出的显著性因素SLCO1B1 rs4149-056 TT/TC作为自变量，结合年龄、身高、体重、体表面积、危险度等可能与排泄延迟发生具有相关性的因素带入Logistic 回归分析，筛选出SLCO1B1 rs4149056 TC为显著性自变量（P＜0.05），回归模型公式为：logit(P)=2.137X-1.490（X=1为基因变异，X=0为基因未变异），OR=7.434，95%CI（2.459，20.386）。以 SLCO1B1 rs4149056 TC作为MTX化疗后排泄延迟的预测因子构建ROC曲线，AUC为0.618，灵敏度为0.5，特异度为0.755。具体见图1。

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  图1 MTX化疗后排泄延迟的ROC曲线

  Figure 1.The ROC curves of excretion delay after HD-MTX

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2.4.2 MTX不良反应多因素回归分析与ROC 曲线

以是否发生MTX不良反应为因变量，以“2.3”项分析得出的72 h血药浓度、GSTP1 rs1695 AA/AG、SLCO1B1 rs4149056 TT/TC为自变量，结合危险度、48 h血药浓度、排泄延迟等可能与MTX化疗后发生不良反应相关的因素代入Logistic 回归分析，筛选出GSTP1 rs1695 AA、SLCO1B1 rs4149056 TC为显著性自变量（P＜0.05），回归模型公式为：logit(P)=2.859X-1.685（X=1为基因变异，X=0为基因未变异），OR=11.527，95%CI（3.096，48.907）。分别以GSTP1 rs1695 AA和SLCO1B1 rs4149056 TC作为MTX化疗后不良反应的预测因子构建ROC曲线，具体见图2和表4。

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  图2 MTX不良反应的ROC曲线

  Figure 2.The ROC curves of toxic reaction after HD-MTX

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  表格4 预测效力评估

  Table 4.The predictive effectiveness evaluation

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3 讨论

在患儿HD-MTX化疗中，血药浓度一直作为反映MTX毒性作用的客观指标。公认的安全阈值是0.1 moL/L，48 h血药浓度≥1 moL/L和72 h血药浓度≥0.1 moL/L可称为排泄延迟[8-9]。导致排泄延迟的因素有很多，主要分为遗传因素与非遗传因素[9]，本研究对MTX排泄延迟的单因素分析结果显示，排泄延迟的发生与患儿性别、年龄、身高、体重、体表面积以及危险度等非遗传因素均无明显相关性（P＞0.05）。针对遗传因素GSTP1（rs1695、rs537387344）和SLCO1B1（rs2306283、rs4149056）等基因位点分型进行研究后发现，GSTP1基因多性与MTX排泄延迟无明显相关性，与李张艾等[9]对67例患儿ATCI和GSTP1与HD-MTX排泄延迟的相关性研究结果一致。汪洋等[10]对82例ALL患儿进行包括生物学特征、基因位点变异、血生化指标等29个因素的多因素回归分析发现SLCO1B1-T521C（rs41490-56）基因变异可使MTX清除率降低，Ramsey等[4]的研究也发现521T＞C（rs4149056）位点上每个等位基因的变异都将使MTX清除率减少。Radtke等[6]的研究结果亦显示521T＞C变异显著降低甲氨蝶呤的清除。本研究校正性别、年龄、身高、体重及危险度等因素，亦发现SLCO1B1（rs4149056）TC基因型与MTX排泄延迟具有相关性（P＜0.05）。这可能是因为SLCO1B1基因参与编码OAT-P1B1，OATP1B1是主要的摄取转运体之一，介导内源性及外源性物质从血液到肝细胞的转运。521T＞C（rs4149056）变异的单倍体使OATP1B1转运功能下降，减少药物进入肝细胞的速率，从而延迟药物代谢[2-3,11-12]。

国内外研究显示，药物代谢酶的基因多态性是影响患儿体内药物动力学特征及不良反应的重要因素之一，本研究对MTX不良反应（≥2级）的单因素研究结果显示，72 h血药浓度、GSTP1 rs1695 AA/AG基因型、SLCO1B1 rs4149056 TT/TC基因型与不良反应的发生具有相关性。72 h血药浓度与不良反应显著相关，提示不良反应的发生，但72 h这个点处于MTX消除相末端，不良反应已经发生，故实际预示不良反应的价值不大。任艳飞等[13]研究结果显示中高危组患儿携带GSTP1 rs1695 AG+GG基因型者发生胃肠毒性的概率是野生型GSTP1的0.125倍，对于中高危患儿而言，GSTP1 rs1695 G/C基因可作为一项预防胃肠毒性发生的保护性因素。SLCO1B1 rs4149056 TC基因型患儿发生肝肾毒性的风险显著增加（P＜0.05），Radtke等[6]认为SLCO1B1 rs4149056 TC基因位点突变很可能是诱发HD-MTX后期严重不良反应的原因，本试验结果与其一致。这可能是因为SLCO1B1基因多态性对于底物的肝选择性摄取、组织分布有重要作用，SLCO1B1参与编码OATP1B1特异性表达在肝细胞上，同时HD-MTX化疗期间，药物主要以原型通过肾排泄，OATP1B1起到限速作用使甲氨蝶呤清除率下降，甲氨蝶呤暴露时间及强度增加，从而导致肝肾毒性发生率明显增加[1,14-15]。

本研究多因素研究结果显示SLCO1B1 rs4149056 TC基因型患儿MTX排泄延迟率显著增加，GSTP1 rs1695 AA、SLCO1B1 rs4149056 TC基因型显著增加化疗后不良反应的发生概率。分别绘制预测ROC曲线，提示SLCO1B1 rs4149056 TC基因型对MTX排泄延迟和不良反应的发生均具有一定诊断预测价值，临床对于SLCO1B1 rs4149056 TC基因型患儿可提前预判，调整措施预防不良反应的发生，实现个体化治疗。

综上所述，HD-MTX化疗后GSTP1 rs1695 AA基因型患儿发生不良反应风险增大，SLCO1B1 rs4149056 TC基因型患儿发生排泄延迟和不良反应的风险均增大，SLCO1B1 rs4149056 TC基因型对MTX排泄延迟和不良反应具有一定预测价值。鉴于本研究为单中心回顾性分析，样本量有限，且考虑到MTX在体内代谢的复杂性，SLCO1B1 rs4149056 TC基因型对MTX排泄延迟和不良反应的影响可能被代谢途径中其他基因多态性、合并用药等易感因素掩盖，本结论尚待进一步研究验证。

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