目的  建立栀子不同炮制品HPLC指纹图谱分析方法，结合化学模式识别技术为栀子的炮制提供参考。

方法  采用Phenomenex Luna-C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈-0.08%甲酸水溶液为流动相，梯度洗脱；流速：0.85 mL·min^-1；检测波长：240，254，280，330，440 nm，柱温：35℃，进样量：10 μL。采用相似度评价、聚类分析和正交偏最小二乘法-判别分析评价20批栀子不同炮制品指纹图谱。

结果  建立了栀子不同炮制品指纹图谱，共标定17个共有峰，经与对照品比对指认出其中8个化合物。20批栀子相似度为0.901~0.969，通过聚类分析可将样品聚为3类，结合正交偏最小二乘法-判别分析发现5个成分可能是造成栀子不同炮制品差异性的主要差异标志物。

结 论  本研究建立的HPLC指纹图谱结合化学模式识别技术能够反映不同炮制方法栀子的差异，可为栀子的炮制提供参考。

栀子为茜草科植物栀子Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果实，外用消肿止痛，内服用于热病心烦、湿热黄疸、目赤肿痛、火毒疮疡等症[1]。自古以来栀子就有很多炮制方法，其味苦性寒，易损伤脾胃，炮制品可缓和苦寒之性。现代炮制品主要有栀子生品、炒栀子、焦栀子、栀子炭、姜栀子5种规格[2]，其中焦栀子凉血止血[3]，栀子炭收敛止血[4]，姜栀子温中止呕[5]。中国药典2020年版中收载的栀子金花丸（生栀子）、越鞠丸（炒栀子）、龙胆泻肝丸（焦栀子）、荷叶丸（栀子炭）、小儿肝炎颗粒（姜栀子）都应用了栀子的各种炮制品。中国药典2020年版以栀子苷作为指标成分来测定栀子生品、炒栀子、焦栀子等炮制品的含量，不能充分区别栀子和栀子炮制品的质量。中药材指纹图谱借助相似度评价系统，将质控指标由单一成分延伸至整个药材的检测，全面反映中药材内在化学成分信息和变量[6-7]。相关文献多集中在栀子炒制前后有效成分变化及指纹图谱的比较[8-9]，对栀子生品与炒栀子、焦栀子、栀子炭、姜栀子4种不同炮制品指纹图谱的差异比较尚未见研究报道。本试验采用HPLC法建立栀子生品与不同炮制品（炒栀子、焦栀子、栀子炭、姜栀子）指纹图谱，并结合聚类分析（cluster analysis, CA）和正交偏最小二乘法-判别分析（orthogoral partial least square discriminate, OPLS-DA）化学模式识别分析不同炮制方法指纹图谱及化学成分发生的变化，为栀子药材及其炮制品的质量评价及研究提供试验依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20A型高效液相色谱仪（VWD检测器，日本岛津公司）；XSR²020DU/MA型电子天平（d= 0.01 mg，梅特勒托利多公司）；KQ-500DE型数控超声波清洗器（昆山超声波仪器有限公司）。

1.2 试药

对照品：栀子苷（批号：110749-202119，含量以97.7%计）、京尼平苷酸（批号：111828-202005，含量以98.5%计）、绿原酸（批号：110753-202118，含量以96.9%计）、6-姜辣素（批号：110809-202111，含量以 99.1%计）、5-羟甲基糠醛（批号：111626-202215，含量以 99.5%计）、西红花苷I（批号：111588-200501）、西红花苷Ⅱ（批号：111589-202102，质量分数92.1%）、芦丁（批号：100080-202012，质量分数92.2%）均购自中国食品药品检定研究院；栀子药材（安国市安心中药饮片公司，批号：210322、210618、211009、211125）经杭州市肿瘤医院楼云雁主任中药师鉴定为正品；乙腈、甲醇、甲酸均为色谱纯，水为屈臣氏蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 栀子炮制品的制备[1-10]

2.1.1 栀子

取4批栀子原药材，除去杂质，碾碎。编号为S1~S4。

2.1.2 炒栀子

取4批净栀子药材，用文火炒至黄褐色。编号为C1~C4。

2.1.3 焦栀子

取4批栀子原药材，用中火炒至表面焦褐色。编号为J1~J4。

2.1.4 栀子炭

取4批栀子原药材，碾碎，用武火加热炒至表面黑褐色。编号为T1~T4。

2.1.5 姜栀子

取4批栀子原药材，碾碎成块，加姜汁（先将生姜洗净，捣烂，加水适量，压榨取汁，姜渣再加水适量重复压榨一次，合并汁液，即为“姜汁”。姜汁与生姜的比例为1 ∶ 1）拌匀，用文火炒至姜汁被吸尽，取出，晾干。编号为JZ1~JZ4。

2.2 色谱条件

色谱柱：Phenomenex Luna-C₁₈色谱柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.08%甲酸水溶液（B）梯度洗脱（0~16 min，12% A；16~34 min，12%→42% A；34~47 min，42%→52% A；47~60 min，52%→66% A；60~70 min，66%→12% A），波长切换：240 nm（0~16 min，检测京尼平苷酸；34~40 min，检测栀子苷）；254 nm（40~47 min，检测芦丁）；280 nm（26~34 min，检测5-羟甲基糠醛、6-姜辣素）；330 nm（16~26 min，检测绿原酸）；440 nm（47~70 min，检测西红花苷I、西红花苷Ⅱ）；流速：0.85 mL·min^-1，柱温：35℃，进样量：10 μL[11-13]。

2.3 混合对照品溶液的制备

精密称取栀子苷、京尼平苷酸、绿原酸、西红花苷I、西红花苷Ⅱ、芦丁、5-羟甲基糠醛、6-姜辣素对照品适量，置100 mL棕色量瓶中，用甲醇溶解配制成质量浓度分别为0.186 0，0.107 0，0.133 0，0.101 0，0.055 4，0.057 2，0.051 8，0.050 6 mg·mL^-1的混合对照品溶液。

2.4 供试品溶液的制备

取“2.1”项下栀子不同炮制品粉碎成中粉，取约2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加75%甲醇50 mL，称定重量，室温超声（功率：500 W，频率：40 kHz）提取45 min，静置至室温，称重并用75%甲醇补足减少的重量，摇匀，经0.45 μm的微孔滤膜滤过，即得。

2.5 指纹图谱方法学考察

2.5.1 精密度试验

取栀子供试品溶液（编号：S3），连续进样6次分析。结果显示各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为0.14%~0.38%和0.96%~1.59%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.5.2 稳定性试验

取栀子供试品溶液（编号：S3），分别于制备后0，3，6，9，15，20，24 h按“2.2”项下色谱条件分析。结果显示各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为0.52%~0.86%和1.04%~1.68%（n=7），表明供试品溶液在24 h内较稳定。

2.5.3 重复性试验

取同一批栀子（编号：S3），按“2.4”项方法平行制备6份供试品溶液，按“2.2”项色谱条件进样分析。结果显示各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为0.83%~1.15%和1.26%~1.94%（n=6），说明方法重复性良好。

2.6 指纹图谱的生成及相关分析

2.6.1 指纹图谱的建立及相似度分析

取“2.1”项栀子炮制品20批，按样品制备方法制备，按“2.2”项色谱条件进样，记录HPLC图。采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2012A版）”，以S3作为参考图谱，时间窗宽度设为0.1，建立栀子不同炮制品的指纹图谱，结果见图 1。结果栀子生品与4种炮制品共有17个色谱峰，JZ1~JZ4多出1个共有峰（峰19'），J1~J4和T1~T4多出1个共有峰（峰18'），相似度见表1。表明栀子炮制工艺稳定，相同炮制品之间相似度较高。

• 
  图1 20批栀子不同炮制品HPLC指纹图谱

  Figure 1.HPLC fingerprints of 20 batches of different processed products of Gardeniae Fructus

  

• 
  表格1 20批栀子不同炮制品相似度评价结果

  Table 1.Similarity evaluation results of 20 batches of Gardeniae Fructus

  

2.6.2 共有指纹峰的标定及分析

取混合对照品溶液按“2.2”项下色谱条件分析，得混合对照品色谱图，见图2。采用保留时间标定出8个色谱峰，分别为3号峰京尼平苷酸（保留时间14.008 min）、6号峰绿原酸（保留时间22.564 min）、9号峰栀子苷（保留时间36.113 min）、11号峰芦丁（保留时间43.495 min）、14号峰西红花苷I（保留时间52.575 min）、15号峰西红花苷Ⅱ（保留时间 54.578 min）、18'号峰5-羟甲基糠醛（保留时间27.505 min）、19'号峰6-姜辣素（保留时间30.027 min）。选择峰面积响应最大及保留时间适中的9号峰栀子苷为参照峰（S）。

• 
  图2 混合对照品HPLC色谱图

  Figure 2.HPLC chromatogram of mixed substances

  注：3.京尼平苷酸(geniposidic acid)，6.绿原酸(chlorogenic acid)，9.栀子苷(geniposide)，11.芦丁(rutoside )，14.西红花苷I(crocin I)，15.西红花苷II(crocin II)，18,.5-羟甲基糠醛(5-hydroxymethyl-2-furaldehyde)，19'.6-姜辣素(6-gingerol)

  

2.7 化学模式识别

2.7.1 CA

采用SPSS 24.0软件，以17个共有指纹峰峰面积为变量对栀子生品与不同炮制品进行CA，结果见图3。结果显示，20批样品聚为3大类，S1~S4为一类，JZ1~JZ4为一类，C1~C4和J1~J4、T1~T4为一类，说明栀子炮制前后指纹图谱存在差异，栀子经炒制和焦制、炭制后指纹图谱变化相似，而姜制栀子指纹图谱略有不同。

• 
  图3 20批栀子不同炮制品CA图

  Figure 3.Cluster analysis dendrogram of 20 batches of different precessed products of Gardeniae Fructus

  

2.7.2 OPLS-DA

采用OPLS-DA可以更准确地找到导致栀子不同炮制品差异的化学成分，以17个共有指纹峰峰面积为变量，启动SIMCA-P 16.1软件，模型区分参数R²X=0.862，R²Y=0.859，模型预测参数Q2=0.939，表明本试验建立的OPLS-DA模型稳定有效。由图4可知，栀子不同炮制品可分为3类，与CA分析结果一致。图5可知，峰15（西红花苷Ⅱ）＞14（西红花苷I）＞17＞3（京尼平苷酸）＞9（栀子苷）的变量重要性投影（variable importance in the projection，VIP）值＞1，说明上述5个成分可能是作为栀子不同炮制品的质量差异性成分，提示应在以后的研究中多关注。

• 
  图4 20批栀子不同炮制品OPLS-DA得分散点图

  Figure 4.OPLS-DA score plots of 20 batches of different precessed products of Gardeniae Fructus

  

• 
  图5 OPLS-DA模型中20批栀子不同炮制品的VIP值图

  Figure 5.VIP plot of 20 batches of different processed products of Gardeniae Fructus in OPLS-DA

  

3 讨论

3.1 色谱条件的优化

本试验采用二极管阵列检测器进行全波长扫描，结果发现在240，254，330，440 nm波长下栀子苷、京尼平苷酸、芦丁、绿原酸、西红花苷Ⅱ、西红花苷I分别有最大吸收，故选用切换波长法进行测定。分别考察了乙腈、甲醇和不同比列的（0.05%，0.08%，0.1%）甲酸溶液、磷酸溶液组成的流动相系统，不同柱温（25，30，35℃）、不同流速（0.85，0.90，0.95，1.00 mL·min^-1），对指纹图谱的影响，结果得出“2.2”项下色谱条件中指纹图谱出峰数量最多，各色谱峰分离度较好。

3.2 炮制品指纹图谱分析

通过对20批栀子不同炮制品的HPLC指纹图谱比较，发现京尼平苷酸、西红花苷I及西红花苷Ⅱ成分在色谱峰面积方面有明显差异，姜栀子中京尼平苷酸含量最高，栀子生品中最低，加姜可能更有利于京尼平苷酸的溶出[14]，使其含量增加；西红花苷I、西红花苷Ⅱ在栀子生品中也高于其他炮制品，因其热稳定性较差，可能在炮制加热过程中分解降低所致[15]。在色谱峰数目方面发现姜栀子中共有峰（峰19'）、焦栀子和栀子炭的共有峰（峰18'）在栀子生品及炒栀子的指纹中均未被检出，为栀子姜制后、焦制后和炭制后产生的新成分，经与对照品指认分别为6-姜辣素和5-羟甲基糠醛，栀子在焦制和炭制过程中温度升高发生美拉德反应产生5-羟甲基糠醛[16]。栀子不同炮制品功效的变化与其有效成分含量的变化是否存在相关性还需深入探索。

3.3 小结

本研究建立了栀子与4种不同炮制品的指纹图谱，采用指纹图谱软件共标定出17个共有峰,相似度均大于0.9，说明建立的指纹图谱具有较好的稳定性。CA和OPLS-DA两种化学计量模型相互验证，20批样品分为3大类，结果基本一致，还筛选出5个差异性标志成分，能为其不同炮制品质量评价提供试验依据。

1.中国药典2020年版 [S]. 一部. 2020: 259-260.

2.吕辰子, 张晓燕, 王勃, 等. 栀子炮制的现代研究进展[J]. 药物评价研究, 2019, 42(6): 1245-1249.[Lyu CZ, Zhang XY, Wang B, et al. Advances in modern processing of Gardeniae Fructus[J]. Drug Evaluation Research, 2019, 42(6): 1245-1249.] DOI: 10.7501/j.issn.1674-6376.2019. 06.036.

3.胡金梅. 焦栀子炮制工艺优化及其止血凝血效果研究[J]. 中药与临床, 2018, 16(4): 9-11. [Hu JM. Optimization of processing technology of Fructus Gardeniae Praeparatus and its effect on hemostasis and coagulation[J]. Pharmacy and Clinics of Chinese Materia Medica, 2018, 16(4): 9-11.] DOI: CNKI:SUN:LCZY.0.2018-04-003.

4.刘兴朵. 栀子炭的凉血止血作用的炮制机制研究进展[J]. 光明中医, 2020, 35(6): 954-956. [Liu XD. Research progress on the processing mechanism of the cooling and hemostatic effects of Gardenia Charcoal[J].Guangming Journal of Chinese Medicine, 2020, 35(6): 954-956.] DOI: 10.3969/ j.issn.1003-8914.2020.06.059.

5.霍雨佳. 栀子炮制的本草考证[J]. 湖北农业科学, 2022, 61(4): 98-102. [Huo YJ. Herbal textual research on processing of Gardenia jasminoides Ellis[J]. Hubei Agricultural Sciences, 2022, 61(4): 98-102.] DOI: 10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2022.04.019.

6.黄卫娟, 韦卓纯, 姜松, 等. 不同产地姜黄药材高效液相色谱指纹图谱与化学模式识别研究[J].中国药业, 2019, 28(12): 14-17. [Huang WJ, Wei ZC, Jiang S, et al. HPLC fingerprint and chemical pattern recognition of Curcuma Longa from different regions[J].China Pharmaceuticals, 2019, 28(12): 14-17.] DOI: 10.3969/j.issn.1006-4931.2019.12.007.

7.黄慰虎, 杨华, 张项. 克咳片的HPLC指纹图谱研究及聚类分析[J]. 中国药师, 2020, 23(2): 285-288, 333. [Huang WH, Yang H, Zhang SH. Study on HPLC fingerprint and cluster analysis of Keke tablets[J]. China Pharmacist, 2020, 23(2): 285-288, 333.] DOI: 10.3969/j.issn.1006-4931.2019.12.007.

8.刘瑞连, 李鑫, 欧少福, 等. 栀子炒制前后有效成分含量测定及其质量评价研究[J]. 时珍国医国药, 2020, 31(12): 2915-2917. [Liu RL, Li X, OU SF, et al. Study on the content determination and quality evaluation of active ingredient in Gardenia Fructus before and after frying[J]. Lishizhen Medicine and Materia Medica Research, 2020, 31(12): 2915-2917.] DOI: 10.3969/j.issn.1008-0805. 2020.12.025.

9.黄跃前, 程学仁, 吴文平, 等. 基于指纹图谱与多元统计分析的栀子不同炮制品评价[J]. 广东药科大学学报, 2020, 36(6): 765-770. [Huang YQ, Cheng XR, Wu WP, et al. Evaluation of different processed Fructus Gardeniae based on fingerprint and multivariate statistical analysis[J]. Journal of Guangdong Pharmaceutical University, 2020, 36(6): 765-770.] DOI: 10.16809/j.cnki.2096-3653. 2020090404.

10.贵州省食品药品监督管理局. 贵州省中药饮片炮制规范[S]. 2005: 182.

11.何艳. HPLC法同时测定防风通圣颗粒中6种成分的含量[J]. 中国药师, 2021, 24(3): 575-578.[He Y. Simultaneous determination of six components in Fangfeng Tongsheng granules by HPLC[J]. China Pharmacist, 2021, 24(3): 575-578.] DOI: 10.3969/j.issn.1008-049X.2021. 03.035.

12.李会芳, 刘静婷, 郎霞, 等. 基于偏最小二乘法关联分析栀子不同炮制品化学成分与肝肾毒性[J].药物评价研究, 2021, 44(9): 1890-1896. [Li HF, Liu JT, Lang X, et al. Partial least squares analysis of chemical constituents and hepatorenal toxicity in different processed products of Gardenia jasminoides[J]. Drug Evaluation Research, 2021, 44(9): 1890-1896.] DOI: 10.7501/j.issn.1674-6376. 2021.09.011.

13.郑晓萍, 杨晓娟, 杨自荣, 等. HPLC波长切换法同时测定白益镇惊丸中的京尼平龙胆二糖苷、栀子苷、西红花苷Ⅰ、去氢茯苓酸和茯苓酸[J]. 中国药事, 2017, 31(3): 275-280. [Zheng XP, Yang XJ, Yang ZR, et al. Simultaneous determination of genipin-1-β-D-gentiobioside, geniposide,crocin-I, dehydropachymic acid and pachymic acid in Baiyi Zhenjing Wan by HPLC wavelength switching method[J]. Chinese Pharmaceutical Affairs, 2017, 31(3): 275-280.] DOI: 10.16153/j.1002-7777.2017.03.008.

14.钟瑞, 付小梅, 刘婧, 等.姜栀子化学成分及药理作用研究进展[J].广东化工, 2020, 47(22): 228-230.[Zhong R, Fu XM, Liu J, et al. Review on processing product of Gardenia jasminoids roasted with Ginger Juice[J].Guangdong Chemical Industry, 2020, 47(22): 228-230.]DOI: 10.3969/j.issn.1007-1865.2020.22.111.

15.刘方舟, 李园白, 李萌, 等. 基于网络药理学的浙产栀子藏红花素类成分药理作用机制研究[J]. 中草药, 2019, 50(8): 1873-1879. [Liu FZ, Li YB, Li M, et al. Mechanism of crocin compounds from Gardenia jasminoides in Zhejiang province by network pharmacology[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs, 2019, 50(8): 1873-1879.] DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670. 2019.08.015.

16.夏梦雨, 王云, 郑颖豪, 等.基于颜色-成分关联分析比较焦栀子炮制过程不同炒制形态质量变化规律[J]. 中国中药杂志, 2021, 46(9): 2197-2206. [Xia MY, Wang Y, Zheng YH, et al. Quality changes of Gardeniae Fructus Praeparatus processed by different frying methods: a color-component correlation analysis[J]. China Journal of Chinese Materia Medica, 2021, 46(9): 2197-2206.] DOI: 10.19540/j.cnki.cjcmm.20210220.303.