目的  采用超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）和酶联免疫吸附法（ELISA）对胖大海中的黄曲霉毒素进行检测，比较两种方法的检测结果以及方法学差异性。

方法  UPLC-MS/MS法测定：样品采用70%甲醇提取经过免疫亲和柱净化，色谱柱为C₁₈（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），柱温为40℃，流动相为水含0.1%甲酸（A）-甲醇含0.1%甲酸（B），梯度洗脱，流速为0.3 mL·min^-1，多反应检测扫描采集模式，正负离子同时扫描进行数据采集。同时采用ELISA法测定，样品采用甲醇提取，酶联免疫试剂盒反应。

结果  UPLC-MS/MS法测定：黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂线性关系良好，检测限分别为0.013 5，0.002 9，0.008 6，0.003 6 μg·kg^-1，定量限分别为0.045 0，0.009 8，0.028 6，0.011 9 μg·kg^-1，平均回收率分别为98.98%，100.32%，98.53%，99.56%，RSD≤2.42%（n=9）。ELISA法测定：黄曲霉毒素B1和总量的定量限分别为0.16，0.08 μg·kg^-1，检出限分别为0.05，0.02 μg·kg^-1，平均回收率分别为93.07%，89.67%，RSD≤13.99%（n=9）。两种方法测定结果的标准偏差在3.46%~7.63%之间。

结论  UPLC-MS/MS法的定量限低，检测限较低，加样回收率高，灵敏度和准确度较高，结果可靠。与UPLC-MS/MS法相比，ELISA法测定胖大海中黄曲霉毒素总量和黄曲霉毒素B1结果差异较小，未出现假阳性等情况。

胖大海Sterculiae Lychnophora Semen是梧桐科植物灯籽苹婆Sterculia lychnophora Hance的干燥成熟种子，主要功效为清热、润肺、利咽、解毒[1]。胖大海主要依赖于进口，主产于东南亚的老挝、越南、泰国、马来西亚和印度，生产、流通、存储全过程周期较长，各个环节控制不当易受真菌毒素污染而产生黄曲霉毒素。黄曲霉毒素是一种广泛存在于食品和中药材中的外源性污染物，是黄曲霉和寄生曲霉产生的代谢产物，毒性极强，对人及动物肝脏组织有极强的破坏作用，严重时可导致肝癌甚至死亡[2-4]。胖大海是常见的药食两用中药，大量使用也使得黄曲霉毒素致癌的风险不断增加，因此研究胖大海的黄曲霉毒素检测方法尤为重要。

中国药典2020年版四部2351黄曲霉毒素测定法收载的中药黄曲霉毒素测定法包括高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）[5-8]和酶联免疫吸附法（ELISA）[9-10]，前两种方法的前处理复杂、需要配置大型仪器、成本较高、检测时间长，且样本中黄曲霉毒素的提取效率易受所用免疫亲和柱的柱容量、回收率、批间差异和保质期等产品技术参数，以及样品基质复杂度、操作者使用熟练程度、室温等非产品技术参数的制约[11]；ELISA法是中国药典2020年版新增加的一种黄曲霉毒素的检测方法，该方法样品前处理简单，已普遍应用于食品、饲料、兽药等中的黄曲霉毒素毒含量检测，具有高特异性、高灵敏性、快速简便的优点。但也有研究表明ELISA法检测可能出现假阳性或者假阴性，主要受pH值、重金属离子和脂肪的影响[12]。      

本研究分别采用UPLC-MS/MS法测定胖大海中黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂，ELISA法测定胖大海中黄曲霉毒素总量及黄曲霉毒素B₁，并比较两种方法测定不同来源胖大海中黄曲霉毒素总量和黄曲霉毒素B₁的结果差异性，同时考察两种方法在回收率和精密度等方面的差异性，为胖大海的黄曲霉毒素的检验应用提供更多参考依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

超高效液相色谱-串联三重四级杆质谱联用仪（ExionLC™ AD系统+ SCIEX Triple Quad™ LC-MS/MS系统，美国AB SCIEX公司）；EVOLIST型全自动酶联免疫分析仪（美国BIO-RAD公司）；8200型台式数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；XS204型电子分析天平（万分之一，瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司）；BY-R20型高速离心机（北京白洋医疗器械有限公司）；NAI-2500D型多管漩涡混合仪（宁波洛尚智能科技有限公司）。

1.2 试药

黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂ 混合对照品溶液（中国食品药品检定研究院，批号：610001-202107），质量浓度分别为1.08，0.33，1.01，0.30 µg·mL^-1；乙腈、甲醇、甲酸（色谱纯，美国Thermo Fisher公司）；黄曲霉毒素免疫亲和柱（北京华安麦科生物技术有限公司）；黄曲霉毒素总量 ELISA 检测试剂盒（北京华安麦科生物技术有限公司，批号：20210602）；黄曲霉毒素B₁检测试剂盒（北京华安麦科生物技术有限公司，批号：20210802）。

1.3 样品来源

收集胖大海药材共11批，均购于亳州药材市场，样品来源信息见表1，经江苏农牧科技职业学院于兰生主任中药师鉴定为梧桐科植物灯籽苹婆Sterculia lychnophora Hance的干燥成熟种子。

• 
  表格1 胖大海药材的样品来源信息

  Table 1.Sample source information of Sterculiae Lychnophorae Semen

  

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的处理

2.1.1 UPLC-MS/MS法

精密称取试品胖大海粉末（过2号筛）约5 g，置于均质瓶中，加入氯化钠3 g，精密加入70%甲醇溶液75 mL，高速搅拌（搅拌速度＞11 000 r·min^-1）2 min，离心（12 000×g）5 min，精密量取上清液15 mL，置50 mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，离心（12 000×g）10 min，精密量取上清液20 mL，通过免疫亲合柱，流速为3 mL·min^-1，用水20 mL洗脱（必要时可以先用淋洗缓冲液10 mL洗脱，再用水10 mL洗脱），弃去洗脱液，使空气进入柱子将水挤出，再用1.5 mL甲醇洗脱，收集洗脱液，置于2 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.22 μm）滤过，取续滤液，即得。

2.1.2 ELISA法

精密称取胖大海粉末（过2号筛）约2 g至50 mL离心管中，加入20 mL甲醇与其混合，置振荡器上，转速为2 500 r·min^-1，振荡5 min，室温下离心（12 000×g）5 min，取2 mL上清液至10 mL干净离心管中，于50~60℃水浴氮气流下吹干，加入2 mL去离子水涡旋30 s，再加入6 mL三氯甲烷振荡2 min，于室温离心（12 000×g）5 min，取下层三氯甲烷液3 mL至10 mL离心管中，于50~60℃水浴氮气流下吹干，加入1 mL正己烷涡旋30 s，再加入2 mL样本稀释液，涡旋1 min，于室温离心（12 000×g）5 min，去除上层有机相，取下层清液50 μL用于分析。

2.2 UPLC-MS/MS法检测条件

色谱条件：色谱柱：Phenomenex Kinetex C₁₈ （100 mm × 2.1 mm, 1.7 μm）；柱温：40℃ ；流速：0.3 mL·min^-1；进样量：1 μL；流动相：A为水含0.1%甲酸，B为甲醇含0.1%甲酸，梯度洗脱程序见表2。

• 
  表格2 UPLC梯度洗脱程序

  Table 2.Gradient elution program by UPLC

  

质谱条件：离子源：电喷雾离子源；扫描方式：多反应检测扫描（MRM）采集模式，正负离子同时扫描；离子喷雾电压: 5 500 V(+)/ 4 500 V(-)；气帘气：35 psi；雾化气：55 psi；辅助气：60 pis；离子源温度：550℃；碰撞气：9 psi。黄曲霉毒素MRM质量分析参数见表3，离子质谱碎片见图1。

• 
  表格3 4 种黄曲霉毒素的质谱参数

  Table 3.MRM transitions of four aflatoxins

  注：*定量离子

  

• 
  图1 4种黄曲霉毒素 MRM 离子质谱碎片

  Figure 1.MS spectra of four aflatoxins

  

2.3 UPLC-MS/MS法的方法学考察

2.3.1 线性关系考察

取混合对照品溶液1 mL置100 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度作为储备液，再以甲醇稀释成含黄曲霉毒素B₁ 10.800 0，5.400 0，2.700 0，1.350 0，0.675 0，0.135 0 ng·mL^-1；黄曲霉毒素B₂ 3.300 0，1.650 0，0.825 0，0.412 5，0.206 2，0.041 2 ng·mL^-1；黄曲霉毒素G₁ 10.100 0，5.050 0，2.525 0，1.262 5，0.631 2，0.126 2 ng·mL^-1；黄曲霉毒素G₂ 3.000 0，1.500 0，0.750 0，0.375 0，0.187 5，0.037 5 ng·mL^-1的系列对照品溶液。按 “2.2”项下检测条件进样检测，以黄曲霉毒素质量浓度为横坐标（X，ng·mL^-1），峰面积为纵坐标（Y），进行回归。取最低浓度的对照品溶液稀释10倍后进样，通过进样结果计算方法的检出限和定量限，以信噪比为3的浓度为检测限，以信噪比为10的浓度为定量限，结果见表4，离子色谱图见图2。

• 
  表格4 UPLC-MS/MS 法测定4种黄曲霉素线性关系

  Table 4.Linear relationship of four aflatoxins by UPLC-MS/MS

  

• 
  图2 4种黄曲霉毒素MRM提取离子色谱图

  Figure 2.MRM chromatograms of four aflatoxins

  

2.3.2 重复性试验

取同一批（批号：304058-1912037）样品，按照“2.1.1”项下方法平行制备供试品溶液，按“2.2”项下检测条件分别进样，测定样品中4 种黄曲霉毒素含量，结果样品平均含量的RSD＜3%（n=6），表明方法重复性良好。

2.3.3 精密度试验

取含黄曲霉毒素B₁ 2.700 0 ng·mL^-1、黄曲霉毒素B₂ 0.825 0 ng·mL^-1、黄曲霉毒素G₁ 2.525 0 ng·mL^-1、黄曲霉毒素G₂ 0.750 0 ng·mL^-1的混合对照品溶液，按“2.2”项下检测条件连续进样6次，测定4种黄曲霉毒素峰面积RSD，计算日内精密度；每天重复3次，3 d重复进样进行日间精密度测定，结果RSD＜3%（n=6），表明方法精密度良好。

2.3.4 加样回收率试验

取同一批（批号：304058-1912037）样品约2.5 g，置于均质瓶中，加入氯化钠3 g，分别向其中精密加入2 mL高、中、低3个不同质量浓度的黄曲霉毒素混合对照品溶液（其中低质量浓度黄曲霉毒素混合对照品溶液含黄曲霉毒素B₁ 0.135 0，B₂ 0.041 2，G₁ 0.126 2，G₂ 0.037 5 ng·mL^-1；中质量浓度黄曲霉毒素混合对照品溶液含黄曲霉毒素B₁ 1.350 0，B₂ 0.412 5，G₁ 1.262 5，G₂ 0.375 0 ng·mL^-1；高质量浓度黄曲霉毒素混合对照品溶液含黄曲霉毒素B₁ 5.400 0，B₂ 1.650 0，G₁ 5.050 0，G₂ 1.500 0 ng·mL^-1），精密加入70%甲醇溶液70 mL，按 “2.1.1” 项下方法自“高速搅拌2 min”起制备供试品溶液，每个加标水平重复3次，按“2.2”项下检测条件进样测定，计算4种黄曲霉毒素的加样回收率，结果胖大海中黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂的平均加样回收率分别为98.98%，100.32%，98.53%，99.56%，RSD分别为2.22%，2.42%，1.84%，2.25%（n=9）。

_{2.4 ELISA法测定黄曲霉毒素B1及总量}

将试剂盒从冷藏环境中取出，置于室温（20~25℃）平衡30 min以上，注意每种液体试剂使用前均需摇匀。将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做3孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。将样品和试剂分别放入全自动酶联免疫分析仪中，按如下设定程序进行分析：加标准品、样本50 μL到对应的微孔中，再加入黄曲霉毒素总量（以黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂的总量计）和黄曲霉毒素B₁的酶标物50 μL/孔，最后加入黄曲霉毒素总量和黄曲霉毒素B₁抗试剂50 μL/孔。轻轻振荡混匀，25℃避光环境中反应30 min。用洗涤液250 μL/孔，充分洗涤4~5次，每次间隔10 s。加入底物液A液50 μL/孔，再加底物液B液50 μL/孔，轻轻振荡混匀用盖板膜盖板后置25℃避光环境反应15 min。加入终止液50 μL/孔，轻轻振荡混匀，于450 nm 处，参比波长630 nm，测定每孔吸光度（A）值，按下式计算百分吸光率：

百分吸光率（%）= B/B₀×100%式中，B为标准品溶液的A值；B₀为0 μg·L^-1标准品的A值。

以黄曲霉毒素标准品溶液浓度的对数值（lgC）为横坐标（X），标准品溶液的百分吸光率为纵坐标（Y），分别绘制黄曲霉毒素总量的标准曲线。另精密吸取“2.1.2”项下的供试品溶液，按上述方法测定吸光度值并计算百分吸光率，从标准曲线上分别读出供试品中所含的黄曲霉毒素总量的浓度，计算，即得。若测定结果超出标曲线性范围则需以样本稀释液进行稀释，再行测定，直至测定结果在线性范围内。

2.5 ELISA法的方法学考察

2.5.1 线性关系考察

按照“2.4”项下方法对试剂盒所提供的浓度分别为0，0.050，0.150，0.450，1.350 μg·kg^-1的黄曲霉毒素B₁系列对照品溶液和浓度分别为0，0.025，0.075，0.225，0.675 μg·kg^-1黄曲霉毒素总量系列对照品溶液进行测定，并绘制标准曲线，分别取黄曲霉毒素B₁试剂盒、黄曲霉毒素总量试剂盒所提供最高浓度对照进行倍比稀释，同时制备空白对照，以对照品检出数值与空白对照检出数值（P/N）为3.0时所对应的质量浓度为最低检出限，以P/N为10.0时所对应的质量浓度为定量限，结果见表5。

• 
  表格5 ELISA法测定黄曲霉素B1及总量的线性关系

  Table 5.Linear relationship of four aflatoxins by ELISA

  

2.5.2 加样回收率及精密度试验

取同一批（批号：304058-1912037）样品约1 g置50 mL离心管中，分别向其中精密加入2 mL试剂盒中所配备的高、中、低3个不同质量浓度的黄曲霉毒素B₁对照品溶液和黄曲霉毒素总量对照品溶液（其中黄曲霉毒素B₁对照品溶液低、中、高3个不同质量浓度分别为0.150，0.450，1.350 μg·kg^-1；黄曲霉毒素总量对照品溶液低、中、高3个不同质量浓度分别为0.075，0.225，0.675 μg·kg^-1），加入18 mL甲醇与其混合，按“2.1.2”项下方法自“置振荡器上，转速为2 500 r·min^-1”起制备供试品溶液，每个加标水平做3个复孔，按“2.4”项下方法进行测定，ELISA法测定胖大海中黄曲霉毒素B₁及黄曲霉毒素总量的平均回收率分别为93.07%，89.87%，RSD分别为13.99%，9.90%（n=9）。

2.6 两种方法的测定结果比较

取样品，分别按“2.1.1”和“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下试验条件和“2.4”项下方法，同时用UPLC-MS/MS法和ELISA方法检测11批胖大海黄曲霉毒素总量和黄曲霉毒素B₁的含量，结果见表6。

• 
  表格6 2种方法检测11批胖大海样品的结果

  Table 6.Results of 11 batches of Sterculiae Lychnophorae Semen samples by two methods

  

3 讨论

本研究同时采用UPLC-MS/MS法和ELISA法检测了11批胖大海中黄曲霉毒素含量，结果表明UPLC-MS/MS方法检测黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂的线性范围分别为0.135 0~10.800 0 μg·kg^-1、0.412 5~3.300 0 μg·kg^-1、0.631 2~10.100 0 μg·kg^-1、0.037 5~3.000 0 μg·kg^-1，黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂的检测限分别为0.013 5，0.002 9，0.008 6，0.003 6 μg·kg^-1，定量限分别为0.045 0，0.009 8，0.028 6，0.011 9 μg·kg^-1，平均加样回收率分别为98.98%，100.32%，98.53%，99.56%，RSD均＜3%（n=9）。ELISA法测定黄曲霉毒素B₁和黄曲霉毒素总量的检测线性范围分别为0~1.350 μg·kg^-1和0~0.675 μg·kg^-1；定量限分别为0.16，0.08 μg·kg^-1，检出限分别为0.05，0.02 μg·kg^-1，平均加标回收率分别为93.07%和89.87%，RSD均＜14%（n=9）。结果表明两种方法均能够作为胖大海中黄曲霉毒素定性定量检测的有效方法，但UPLC-MS/MS法测定黄曲霉毒素B₁和计算其总量的平均加样回收率在（100±2）%范围内，RSD＜3%（n=9），而ELISA法测定黄曲霉毒素B₁和总量的平均加样回收率在（100±11）%范围内，RSD＜14%（n=9），表明UPLC-MS/MS法准确度优于ELISA法，精密度更好，数据更加可靠，且检测限和定量限更低，灵敏度更高。

对两种方法的检测结果进行比较分析，两种方法检测11批胖大海，均有3批样品检出黄曲霉毒素，两种方法检测结果基本一致，其中两种方法检测黄曲霉毒素总量结果的相对偏差范围为3.46%~4.68%，黄曲霉毒素B₁标准偏差范围为5.45%~7.63%，均未超过10%。表明ELISA法测定胖大海中黄曲霉毒素总量和黄曲霉毒素B₁结果与UPLC-MS/MS法所测结果差异较小，且未出现假阳性等情况。此外，此次共检测11批样品，UPLC-MS/MS法平均每批耗时2.5 h，ELISA法平均每批耗时0.5 h，检测成本UPLC-MS/MS法是ELISA法的数十倍，且仪器昂贵，技术门槛较高。

综上所述，ELISA法作为胖大海中黄曲霉毒素快速检测方法，虽然灵敏度和准确度略低，但是简化了操作流程，降低了检测成本，提高了检测效率，而UPLC-MS/MS法作为药典仲裁法具有准确度、灵敏度高，结果可靠等优点，但试验成本较高、耗时较长。可具体根据具体检测需求和实际情况不同选择最合适的方法进行检测。

1.李昆, 姚婷, 宁雪雪, 等. 黄曲霉毒素的研究进展[J].

农产品加工, 2017, 434(6): 61-63, 66. [Li K, Yao T, Ning XX, et al. The research progress of aflatoxin[J]. Farm Products Processing, 2017, 434(6): 61-61, 66.] DOI: 10.16693/j.cnki.1671-9646(X).2017.06.050.

2.汪杨, 王嫣, 杨雅婷, 等. 甘草饮片中微生物及真菌毒素污染状况考察[J]. 中国药师, 2021, 33(11): 2114-2117. [Wang Y, Wang Y, Yang YT, et al. Study on contamination of microorganism and mycotoxin in glycyrrhizea decoction pieces[J]. China Pharmacist, 2021, 33(11): 2114-2117.] DOI: 10.19962/j.cnki.issn1008-049X.2021.11.033

3.杨美华. 药用植物及其产品中真菌及真菌毒素污染研究进展[J]. 贵州农业科学, 2008, 6(36): 59-63.[Yang MH. Research progress in fungi and mycotoxin infection of medicinal plants and their products[J]. Guizhou Agricultural Sciences, 2008, 6(36): 59-63.] DOI: 10.3969/j.issn.1001-3601.2008.06.025

4.王如峰, 安燕南, 袁铭, 等. HPLC指纹图谱法评价市售胖大海的质量一致性[J]. 中国实验方剂学杂志, 2013, 19(17): 83-86. [Wang RF, An YN, Yuan M, et al. Quality coherence evaluation of the seeds of sterculia lychnophora commercially available in china based on HPLC fingerprint[J]. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae, 2013, 19(17): 83-86.] DOI: 10.11653 /syfj2013170073.

5.黄晓燕, 方磊, 李荣玮, 等. HPLC法测定小儿扶脾颗粒中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2含量[J]. 中国药师, 2018, 21(2): 334-336. [Huang XY, Fang L, Li RW, et al. Determination of aflatoxins B1, B2, G1 and G2 in Xiao'er Fupi granule by HPLC[J]. China Pharmacist, 2018, 21(2): 334-336.] DOI: 10.3969/j.issn.1008-049X.2018.02.042.

6.孟繁磊, 宋志峰, 牛红红, 等. 基于UPLC-MS-MS技术快速测定花生中4种黄曲霉毒素[J].中国油脂, 2018, 43(1): 136-139. [Meng FL, Song ZF, Niu HH, et al. Rapid determination of four kinds of aflatoxins in peanut by UPLC-MS-MS[J]. China Oils and Fats, 2018, 43(1): 136-139.] DOI: 10.3969/j.issn.1003-7969.2018.01.033.

7.Zhang Z, Hu X, Zhang Q, et al. Determination for multiple mycotoxins in agricultural products using HPLC-MS/MS via a multiple antibody immunoaffinity column[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 2016, 1021: 145-152. DOI: 10.1016/j.jchromb.2016.02.035.

8.Siddique NA, Mujeeb M, Ahmad S, et al. Determination of aflatoxins in medicinal plants by high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. J Pharm Pharm Sci, 2012, 16(2): 321-330. DOI: 10.2147/IJN.S51203.

9.中国药典2020年版. 一部[S]. 2020: 280-285.

10.南铁贵, 洪小栩, 徐昕怡, 等. 中药黄曲霉毒素测定酶联免疫吸附法的研制[J]. 中国中药杂志, 2020,  45(17): 4158-4162. [Nan TG, Hong XX, Xu XY, et al. Development of enzyme linked immunosorbent assay of aflatoxin of Chinese herbal medicines[J]. China Journal of Chinese materia Mediica, 2020, 45(17): 4158-4162.] DOI: 10.19540/j.cnki.cjcmm.20200608.101.

11.季澜洋. 酶联免疫吸附法测粮食中黄曲霉毒素的研究探讨[J]. 黑龙江科技信息, 2011, 21(5): 270. [Ji LY. Study on determination of aflatoxin in grain by enzyme-linked immunosorbent assay[J]. Heilongjiang Science and Technology Information, 2011, 21(5): 270.] DOI: CNKI:SUN:HLKX.0.2011-28-260.

12.韦芳, 廖晓芳, 刘晓菲, 等. 中药材等复杂基质中真菌毒素检测的前处理技术研究新进展[J].中国中药杂志, 2018, 43(17): 3431-3443. [Wei F, Liao XF, Liu XF, et al. Research progress of pretreatment technology for mycotoxin detection in Chinese materia medica and complex matrices[J]. China Journal of Chinese materia Mediica, 2018, 43(17): 3431-3443.] DOI: 10.19540/j.cnki.cjcmm.20180529.001.