目的  采用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱联用（UPLC-Q-TOF-MS/MS）技术对腰康宁汤中化学成分进行快速鉴定。

方法  采用ACQUITY  UPLC BEH C₁₈色谱柱（150 mm×2.1 mm，1.7 μm），流动相为0.2%甲酸水溶液-甲醇，梯度洗脱，流速：0.5 mL·min^-1，柱温：40℃，进样量：3 μL；电子喷雾离子源，在正、负离子模式下对色谱流出物质进行质谱检测。

结果  通过与对照品对照和结合文献，从腰康宁汤中鉴定出山奈苷、宝藿苷Ⅰ、葛根素、毛蕊异黄酮苷、芍药苷、夏佛塔苷、芒柄花苷、丹酚酸B、二十八烷酸、2-乙氧羰基-5,7-二羟基-4-甲氧基异黄酮10种成分。

结论 建立的定性分析方法能快速、系统地分析腰康宁汤中的化学成分，为该方的质量控制及药效物质基础研究提供了理论基础。

腰痛是骨科临床最为常见的疾病，由于病情复杂、病程长以及治疗费用高等原因，给社会和患者造成了极大负担[1]。其中椎间盘退行性病变是腰痛的主要原因，其具体表现为可见纤维环及髓核细胞变性坏死，严重时出现纤维环破裂、髓核突出、软骨终板变薄、破裂等病变[2]。椎间盘退行性病变属于中医学中“腰痛病”、“痹病”范畴，其症状以腰背部疼痛、下肢麻木等为主，其中医病因病机为肾虚血瘀，补肾活血类中药在临床中具有良好疗效[3-4]。历代医家通过临床实践经验，总结出补益肝肾及活血祛瘀是治疗腰痛椎间盘退行性病变的原则，该治疗原则利用补肝肾药使其肾气旺，以治疗其本虚的病变特点，又利用活血中药，使瘀血祛除、经脉通畅，从而症状得以消除。腰康宁汤是南京市中西医结合医院名中医经验方，由黄芪、独活、寄生、牛膝、当归、白芍、川芎、肉桂、丹参、葛根、地龙、全蝎组成，是在独活寄生汤（《备急千金要方》）基础上，运用辨证论治进行组方，由黄芪、独活、当归、丹参、葛根等中药组成。全方补肾健脾治本，活血通络治标，用于治疗椎间盘退行性病变等腰痛疾病，在临床应用已有20余年，疗效确切。

目前，对于腰康宁汤中有效成分的鉴定分析仍存在空白，发挥药效的物质基础尚不明确。本文基于超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱联用（UPLC-Q-TOF-MS/MS）技术首次鉴定分析腰康宁汤中有效成分，为腰康宁汤药效基础及作用机制探讨提供实验依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Triple Q-TOF 5600质谱仪Applied Bio-systems，包括电喷雾离子源ES系统（美国AB Sciex公司）； LC-20AD XR 液相色谱仪，包括DGU-20A3 脱气装置、SIL-20A XR 自动进样器、CTO-20AC 柱温箱（日本 Shimadzu 公司）；数据采集和处理采用 Analyst TF 1.6和 PeakView 1.2软件；KH-500DE 型超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；STP FA2004电子天平（上海上平仪器有限公司）；BT125D电子天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]。

1.2 试药

葛根素（批号：110752-201816）、宝藿苷Ⅰ（批号：111852-201603）、毛蕊异黄酮苷（批号：111920-201102）、芍药苷（批号：110736-201842）、芒柄花苷（批号：111703-201204）、丹酚酸B（批号：111562-201716）等对照品均购自中国食品药品检定研究所；山奈苷对照品（批号：20161105，北京普天同创生物科技有限公司）；夏佛塔苷对照品（批号：HA0828XA13，上海源叶生物科技有限公司）；甲醇(质谱纯，Merck Germany)；甲酸（质谱纯，Merck Germany)；超纯水（色谱纯，屈臣氏）；乙腈（色谱纯，Merck Germany）。

腰康宁汤处方药材：黄芪（产地：甘肃定西，购自岷县和泰中药材有限公司，批号：20210501）；独活（产地：四川阿坝，购自安徽亳州市场，批号：20210828）；寄生（产地：黑龙江宁安，购自安徽亳州市场，批号：20200915）；牛膝（产地：四川绵阳，购自成都荷花池中药材市场，批号：190305）；当归（产地：甘肃定西，购自岷县归乡源中药材有限公司，批号：190506）；白芍（产地：安徽亳州，购自安徽亳州市场，批号：190401）；川芎（产地：四川灌县，购自江西江中中药饮片有限公司，批号：190519）；肉桂（产地：广西桂平，购自安徽亳州市场，批号：20201226）；丹参（产地：山东菏泽，购自亳州市京皖中药饮片厂，批号：201108）；葛根（产地：云南曲靖，购自四川盛世锦荣药业有限公司，批号：190808）；地龙（产地：广西，购自安徽亳州市场，批号：S200103）；全蝎（产地：山东济南，购自安徽亳州市场，批号：S210908）；以上中药饮片均由南京中医药大学附属南京市中西医结合医院提供，并经南京中医药大学附属南京市中西医结合医院中药房徐德荣副主任中药师鉴定均符合中国药典2020年版标准。

2 方法与结果

2.1 样品的炮制

各饮片按院内组方，加6倍量水浸泡30 min，加热煮沸后再煎煮30 min取汁；第二煎加5倍量水，同前煎煮后取汁，将以上2次煎煮好的药液均匀混合，以洁净纱布滤除药渣，药液用旋转蒸发仪浓缩至生药含量1.56 g·kg^-1，常温冷却后，置于4℃冰箱中保存备用。

2.2 色谱条件

ACQUITY UPLC BEH C₁₈色谱柱（150 mm× 2.1 mm，1.7 μm，Waters公司）；柱温：40℃；流动相：甲醇(A) -0.2%甲酸水溶液(B)，梯度洗脱（0~20 min，95%~65%A；20~45 min，65%~40%A；45~60 min，40%~30%A）；流速：0.5 mL·min ^-1；进样量：3 μL。

2.3 质谱条件

采用 TOF MS-IDA-MS /MS 模式，正离子检测方式，喷雾电压：5 500 eV，离子源温度：50℃，气帘气（N₂）：40 Pa，雾化气（N₂）：60 Pa，辅助气（N₂）：60 Pa，去簇电压：70 eV，IDA条件下设置碰撞电压：45 eV，碰撞压差：15 eV，开启动态背景扣除。负离子检测方式，喷雾电压：5 500 eV，离子源温度：550℃，气帘气（N₂）：40 Pa，雾化气（N₂）：60 Pa，辅助气（N₂）：60 Pa，去簇电压：70 eV，IDA条件下设置碰撞电压：45 eV，碰撞电压差：15 eV，开启动态背景扣除。

2.4 供试品溶液及对照品溶液的制备

取样品溶液200 mg（生药量1.56 g·kg^-1），精密称定，置具塞锥形瓶中，加25 mL 70% 甲醇，称定重量，超声（功率：400 W，频率：40 kHz）处理 30 min，放冷，加70%甲醇补足失重，摇匀，过 0.22 μm 微孔滤膜，取续滤液，即得。分别取葛根素、毛蕊异黄酮苷、芍药苷、芒柄花苷、丹酚酸B、夏佛塔苷对照品适量，精密称定，加70% 甲醇配制成质量浓度为0.44，0.10，0.13，0.51，0.20，0.18 mg·L^-1。

2.5 数据分析

采用 PeakView 1.2软件进行处理，分离出腰康宁中相关成分化合物谱的离子碎片，结合文献和数据库对潜在的化学标记物进行鉴定。

2.6 主要化合物鉴定及归属

取上述供试品和混合对照品溶液，按照“2.2”和“2.3”项下条件进行测定，得正负离子模式下总离子流色谱图，见图1。各色谱峰峰形及离度较好，获取各化学成分的保留时间、质谱准分子离子峰和碎片离子峰等信息，对比对照品图谱和相关文献，分析化学成分的裂解过程，推测化学成分，结果见表1。

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  图1 腰康宁汤在正离子模式（A）和负离子模式（B）下的总离子流图

  Figure 1.Total ion chromatograms of Yaokangning decoction in positive (A) and negative (B) mode

  

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  表格1 腰康宁汤化学成分的UPLC-Q-TOF-MS/MS分析

  Table 1.Analysis of chemical constituents of Yaokangning decoction by UPLC-Q-TOF-MS/MS

  注：-表示未检出

  

2.6.1 黄酮类

从腰康宁汤中共鉴定出7个黄酮类成分，包括化合物1~4、6、7、10，该类化合物主要以游离苷元或者与糖结合形成苷类，其裂解方式主要包括 CO、CO₂等中性离子丢失、RDA 裂解及糖基断裂。以葛根素为例，在负离子模式下，其m/z值[M+H⁺]为417.118 0，参考其二级质谱碎片m/z 267.15，297.22，根据对照品图谱与相关文献[5-8]，表明该化合物为葛根素。宝藿苷I属于脱水类淫羊藿素母核结构的黄酮类化合物，在裂解过程中易发生脱糖基、脱H₂O等中性分子。其中在负离子模式下，失去7-位的糖基，通过苷元离子m/z 367二级质谱碎片鉴别，推测该化合物为宝藿苷Ⅰ。

2.6.2 有机酸类

从腰康宁汤中共鉴定出2个有机酸类成分，为化合物8、9。有机酸类化合物一般有酚羟基、羧基、磺酸基和硫羧酸基等基团，在负离子模式下的响应优于正离子式模式，裂解方式主要包括CO、H₂O、-COOH 等小分子丢失。以丹酚酸B为例，在负离子模式下，失去1个H，得到分子离子峰m/z 717.146 1，结合二级质谱碎片，分别丢失一个CO与一个H₂O，再根据相关文献[9-11]，推测该化合物为丹酚酸B。

2.6.3 单萜糖苷类

从腰康宁汤中共鉴定出1个单萜糖苷类成分，为化合物5。芍药苷及其衍生物的质谱裂解规律具有一定的相似性，m/z 165的蒎烷基本骨架碎片离子为芍药苷衍生物的特征碎片离子，同时也会生成葡萄糖、苯甲酸等不同基团的碎片离子。芍药苷在负离子模式下失去1个H m/z值481.170 4，结合蒎烷基本骨架碎片离子，根据对照品图谱与相关文献[12-15]推测该化合物为芍药苷。

3 讨论

在前期试验过程中，课题组尝试了通过HPLC系统进行分离分析，但在随后的分析过程中发现在HPLC系统条件下，无法全面地获得腰康宁汤中的活性成分，且在液相系统中，无法证实化合物的峰之间是否产生叠连，即峰是否仅对应1个化合物的相关问题。为此，本试验首次建立了UPLC 联合Q-TOF-MS方法快速鉴定分析腰康宁汤中的成分，其中本试验检测出的宝藿苷Ⅰ、葛根素、毛蕊异黄酮苷、芍药苷、芒柄花苷化学成分已在药理学实验中证实能抑制椎间盘退行性病变 [16-20]，提示这些成分极有可能是腰康宁汤中发挥药效的物质基础，也为后期研究腰康宁汤有效成分治疗腰痛椎间盘退行性病变的作用机制奠定了基础。

在流动相考察中，分别使用甲醇-0.5%磷酸、乙腈-0.1%甲酸、0.2%甲酸水-甲醇等溶液进行梯度洗脱[21-22]，结果表明0.2%甲酸水溶液-甲醇流动相下各峰值更为显著，基线更稳定。在供试品制备方法考察中，分别将供试品溶于超纯水，30%，50%，70%，80%的甲醇溶液中，结果发现70%甲醇提取效果最佳，此时各成分峰的响应值高且杂质出峰率较低。

此外，本试验也存在不足之处，腰康宁汤中肉桂药材含有多种挥发性物质，未能在本方法中检测出来，在下一步试验中将采用GC-MS联用技术分析本方中的挥发性成分，同时进行光学异构的同分异构体的分析与鉴别。

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